轉(zhuǎn)基因探針法PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)的條件選擇介紹
點(diǎn)擊次數(shù)：501 更新時(shí)間：2022-04-15
轉(zhuǎn)基因探針法PCR試劑盒是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。
在轉(zhuǎn)基因探針法PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括：
1、固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
2、酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取"方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
3、包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。
4、酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
